Naukowcy z Zakładu Biotechnologii Medycznej Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ odkrywają nieznane wcześniej mechanizmy zaburzeń funkcji serca u pacjentów z dystrofią mięśniową Duchenne’a (DMD). Ich badania ukazały się właśnie w "Cardiovascular Research" (Oxford University Press), jednym z najważniejszych czasopism z zakresu badań podstawowych i klinicznych nad chorobami serca i chorobami układu krążenia.
W ramach badań realizowanych dzięki grantowi MAESTRO z Narodowego Centrum Nauki (NCN), zespół prof. Józefa Dulaka, kierownika Zakładu Biotechnologii Medycznej UJ, przedstawił wyniki wskazujące na zaburzenia gospodarki żelazowej w komórkach serca (kardiomiocytach) pozbawionych dystrofiny. Mutacje prowadzące do braku tego białka - kluczowego dla funkcji serca, mięśni szkieletowych i oddechowych - są przyczyną DMD, ciężkiej i nieuleczalnej choroby genetycznej dotykającej niemal wyłącznie chłopców. Pierwszymi objawami choroby są trudności w chodzeniu pojawiające się w wieku ok. 2-3 lat. Gdy chłopcy osiągają wiek nastoletni, postępujące uszkodzenie mięśni powoduje znaczną niepełnosprawność i konieczność poruszania się chorych na wózku inwalidzkim, a rozwijająca się niewydolność mięśni oddechowych i przede wszystkim serca (kardiomiopatia) są przyczyną przedwczesnej śmierci młodych mężczyzn, najczęściej w 3. dekadzie życia.
W pracy "Dysregulated iron homeostasis in dystrophin-deficient cardiomyocytes: correction by gene editing and pharmacological treatment", której pierwszym autorem jest dr Kalina Andrysiak, wcześniej doktorantka prof. Józefa Dulaka i dr. Jacka Stępniewskiego, naukowcy wykorzystali indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC, ang. induced pluripotent stem cells). Metoda uzyskiwania takich komórek, wyróżniona w roku 2012 nagrodą Nobla dla jej twórcy prof. Shinyi Yamanaki pozwala na uzyskanie komórek macierzystych poprzez odpowiednie genetyczne przeprogramowanie komórek zróżnicowanych, np. komórek skóry czy białych krwinek. iPSC można następnie różnicować do dowolnych komórek dorosłego organizmu, m.in. kardiomiocytów (pokazanych na fotografii), których uzyskanie od pacjentów jest bardzo utrudnione lub wręcz niemożliwe.
We współpracy z zespołem prof. Anny Kostery-Pruszczyk i dr hab. Anny Potulskiej-Chromik z Kliniki Neurologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego, po uzyskaniu odpowiedniej zgody komisji bioetycznej i akceptacji rodziców oraz pacjentów, krakowscy badacze wyizolowali białe krwinki z niewielkiej ilość krwi pobranej od pacjentów. Następnie przekształcili te leukocyty w laboratorium do iPSC. Dodatkowo, w celu prawidłowego porównywania efektu mutacji naprawili gen DMD w komórkach pacjentów za pomocą metody edycji genów CRISPR/Cas9. To kolejna technika wyróżniona nagrodą Nobla w roku 2020 dla prof. Jennifer Doudny i prof. Emmanuelle Charpentier.
Dzięki tym zabiegom badacze z Zakładu Biotechnologii Medycznej mogli porównywać chore kardiomiocyty (pozbawione dystrofiny) oraz zdrowe (z naprawioną mutacją w genie dystrofiny). Wykonali także odwrotne manipulacje, wprowadzając mutację w genie dystrofiny w iPSC otrzymanych poprzez przeprogramowanie leukocytów zdrowych dawców. W ten sposób stworzyli odpowiednie komórkowe modele choroby DMD.
Przeprowadzone badania wykazały po raz pierwszy zaburzenia w gospodarce żelazowej w kardiomiocytach pozbawionych dystrofiny. Ponieważ kardiomiocyty otrzymane z iPSC odpowiadają komórkom serca u bardzo młodych pacjentów, uzyskane wyniki sugerują, że podobny problem może występować już w sercach kilkuletnich chłopców z dystrofią mięśniową Duchenne’a. Jak wskazują badacze, przyczyną tych problemów może być zaburzenie funkcji białka mitoNEET, odpowiedzialnego za usuwania żelaza z mitochondriów (komórkowych generatorów energii), którego poziom był niższy w kardiomiocytach pozbawionych dystrofiny w porównaniu z komórkami zdrowymi. Co ważne, naprawa mutacji w genie dystrofiny poprzez jego edycję za pomocą CRISPR/Cas9 przywracała prawidłowy poziom białka mitoNEET, wskazując, że ta technika, obecnie już stosowana lub testowana w terapii innych chorób (ostatnio zarejestrowano terapię CRISPR/Cas9 do leczenia niedokrwistości sierpowatokrwinkowej oraz talasemii) może być w przyszłości rozważana jako sposób na poprawę funkcji serca pacjentów cierpiących na DMD.
Dr Kalina Andrysiak, dr Jacek Stępniewski i prof. Józef Dulak ze współpracownikami wykazali następnie, że zaburzenia gospodarki żelazowej i jego konsekwencje (zwiększone wytwarzanie niekorzystnych wolnych rodników) mogą być ograniczane poprzez podanie kardiomiocytom drobnocząsteczkowego związku, usuwającego nadmiar żelaza z komórki (deferoksaminy) lub pioglitazonu - stabilizatora białka mitoNEET. Co ciekawe, pioglitazon należy do grupy leków (tiazolidynedionów) stosowanych w terapii cukrzycy, zmniejszając we krwi stężenie glukozy.
Uzyskane wyniki stwarzają zdaniem naukowców podstawy do rozważenia wykorzystania wspomnianych lub podobnych leków w terapii DMD. Dodatkowym uzasadnieniem do ich stosowania mogą być obserwowane w dystrofii Duchenne’a zaburzenia gospodarki węglowodanowej i funkcji insuliny, które potencjalnie mogą być także normalizowane za pomocą pioglitazonu lub podobnych substancji. Oczywiście rozważenie odpowiednich badań klinicznych wymagać będzie jeszcze dalszych badań eksperymentalnych, w celu weryfikacji wyników opisanych w najnowszej pracy naukowców z Zakładu Biotechnologii Medycznej.
Powstanie tej pracy, w której badacze wykorzystali także m.in. techniki globalnej analizy ekspresji genów (transkryptomiki) i produkcji białek (proteomiki), było możliwe dzięki współpracy z innymi zespołami z Uniwersytetu Jagiellońskiego (prof. Elżbietą Pyzą i dr Olgą Woźnicką z Instytutu Zoologii Nauk Biomedycznych, dr. Guillemem Yla i dr Gabrielą Machaj z WBBiB UJ), a także z Uniwersytetu w Kolonii.
Badania nad mechanizmami dystrofii mięśniowej Duchenne’a oraz innych chorób nerwowo-mięśniowych (rdzeniowym zanikiem mięśni - SMA, stwardnieniem zanikowym bocznym – ALS, dystrofią typu LAMA2 - LAMA2-MD) realizowane są w Zakładzie Biotechnologii Medycznej dzięki wsparciu Narodowego Centrum Nauki. Prof. Józef Dulak jest obecnie po raz drugi kierownikiem grantu MAESTRO, kierował także zakończonym niedawno projektem JPND (projekt europejski współfinansowany przez NCN). Prof. Agnieszka Łoboda, współautorka pracy, jest kierownikiem grantu OPUS, w ramach którego bada także inne mechanizmy DMD i sposoby jej terapii. Dr Jacek Stępniewski jest kierownikiem grantu SONATA, w ramach którego analizuje rolę jednego z mikroRNA, zaangażowanego także w przebieg dystrofii mięśniowej Duchenne’a. Dr Kalina Andrysiak jest kierownikiem grantu PRELUDIUM, w ramach którego testowała inne sposoby eksperymentalnej terapii DMD z wykorzystaniem zmodyfikowanej techniki CRISPR/Cas9.
Ludzkie komórki serca (kardiomiocyty) otrzymane poprzez różnicowane indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (Fot. Zakład Biotechnologii Medycznej WBBiB UJ)
